随着现代生物技术的发展，出现了各种多肽类药物，多肽在临床医学中有巨大的应用价值。用反相高效液相色谱（RPLC）对两种化学合成多肽-32肽和21肽进行了分离、纯化和制备，能够提高多肽的纯度。下面分享反相高效液相色谱使用等相关知识。

反相高效液相色谱——流动相pH值调整方法

反相高效液相色谱法由于低pH和高有机溶剂的变性作用，可用于分离和定量不同药物载量的轻、重链。

反相液相色谱（RP-LC）是一种常用的色谱分离技术，其流动相pH值的调整对于分析物的保留行为和分离效果具有重要影响。流动相pH值的调整可以通过以下几个步骤进行：

1、根据目标分析物的化学性质和色谱柱的要求，选择合适的缓冲盐。常用的缓冲盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和三乙胺等。

2、使用pH计对缓冲溶液进行精确测定，确保其符合实验需求。pH值的测量应在预定温度下进行，因为温度变化会影响pH值。

3、如果缓冲溶液的pH值不符合要求，可以使用稀盐酸或稀氢氧化钠溶液进行调整。通常采用滴定法逐渐调整pH值，同时不断搅拌以保证混合均匀。

4、调整pH值后，流动相需要脱气，以避免气泡对色谱分离造成干扰。脱气可以通过超声脱气、真空脱气或在线脱气装置进行。

5、为了防止色谱柱堵塞，需要将流动相过滤。使用0.22微米或0.45微米的滤膜进行过滤。

6、在流动相pH值调整完毕并脱气过滤后，应使用新配制的流动相对色谱系统进行充分平衡，以确保色谱分离的稳定性和重现性。

7、配制好的流动相应储存在干净的容器中，并在低温环境下保存，以防止pH值发生变化。

反相高效液相色谱检测法应用于合成色素

仪器与试剂

仪器：检测仪、漏斗、天平和色谱柱。检测仪使用LC-20，AD配备有二极管的高分离度液相色谱仪，G3垂融漏斗规格为XS 205，G3砂芯滤板漏斗LC-20AD，C18色谱柱规格为4.6 mm×250 mm，5μm以及电子天平和0.45μm水相过滤膜。

试剂：UP水（Ultrapure water），源美制造；磷酸二氢铵、甲酸、氨水，均为分析纯；甲醇、乙醇，均为色谱纯。

标准品

亮蓝纯度大于99.7%，柠檬黄纯度大于91.0%，日落黄纯度规格GBW(E)10003 a，0.5 mg/mL；赤藓红纯度大于91.7%，诱惑红纯度大于80.0%。

标准液的制备

按照标准规格制备标准液，浓度为1.0 mg/mL，首先取适量需要配制的标准品加入25 mL容量瓶中，并使用水定容，逐渐将溶液调制为标准浓度。另外需要注意的是，日落黄其标准的储备溶液与正常溶液浓度不同，浓度为0.5 mg/mL。

混合液的制作配备

混合液需要多种标准液混合在一起，可将既定需要混合的标准液进行混合，混合时首先需要用水将其稀释，进而制备成不同含量的混合液，分别为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，配好后保存待用。

色谱条件

色素条件主要观察色谱柱，其规格4.6 mm×250 mm，5μm，检测波长254 nm，柱温为30℃，进样量为10μL。流速l mL/min。具体梯度条件见表1。

表1流动相梯度条件表

样品处理

称取一定量的片剂研磨，直到研钵中的片剂磨成均匀细碎的粉状后称样。除片剂外还有胶囊和胶囊壳，胶囊壳的制作是将胶囊内的粉粒状物全部取出，用棉签擦拭胶囊壳直至其完全干净无粉粒残留进行称样[3]。将这些试样取出一定量倒进100 mL小烧杯中，然后注入30 mL的水并将水温加至温热至样品溶解，以60℃为准，取1 g聚酰胺粉与水慢慢调制成粥状，进而倒入方才溶解试样的溶液中进行搅拌。进一步将其洗涤，首先用G3垂熔漏斗过滤过的60℃水洗涤3次，进而将甲醇60%与甲酸40%混合好的溶液再洗涤3次，将其洗涤成中性溶液，接着用混合乙醇70%以及氨水20%以及水10%的混合液对溶液进行解吸，一共分4次进行，每次需要5 mL，在解吸后用乙酸进行溶液中和，进而蒸发定容，最后将溶液处理为5 mL，最后用0.45μm滤膜对溶液进行过滤，做液相色谱检测。

稳定性试验

每间隔2 h对标准混合液以液相色谱检测法的色谱条件进行取样分析，及时记录这6种着色剂组分的标准工作曲线的线性关系及相关系数，实验结果表明，各种分浓度与峰面积呈良好线性关系，以3倍噪声比确定最低检出限。线性范围、回归方程、相关系数及检出限见表2。

按照RP-HPLC的方法探讨反相高效液相色谱检测法，测试时采用合成着色剂为样例，并根据保健食品本身的特点以及样剂的剂型的不同进行针对性地检测。本次研究所采取的方法易操作且实验速度上把握良好，混合色素的分离较为顺利且结果上分离度也呈现较好状态，样品稳定性上也呈现良好结果，在回收率上也呈现较为理想的状态。因此本次方法适合保健食品不同着色剂各种剂型的分离检测。

c18色谱柱是什么填料

美国热电Thermo Hypersil ODS（C18）液相色谱柱Hypersil ODS（C18）是硅胶基质上键合了C18为官能团的色谱柱填料，是典型的高效液相色谱柱用填料，适合于分析非极性和中性样品，包括酸性、中性及亲脂性化合物。

C18色谱柱是最常用、每个实验室必备的通用型色谱柱。填料是硅胶基质上键合十八烷基，有较高的碳含量和较好的疏水性，适用于大多数化合物，包括非极性、极性小分子及一些多肽及蛋白质。随着每家色谱柱制造商的研发，C18柱的类型还在不断增加。适用pH范围由原来的2～8，发展到现在1～14，与纯水相的兼容性越来越好，某些色谱柱即使长时间使用100%水相，也不会发生填料疏水塌陷。对于每位实验人员来说，可供选择的范围日趋广泛。

柱型号

C18色谱柱填料类型规格：十八烷基键合球形硅胶250×4.6mm，5μm、200×4.6mm，5μm、150×4.6mm，5μm、250×4.6mm，7μm、、200×4.6mm，7μm、150×4.6mm，7μm。

文章来源：考工、现代食品